免疫熒光法的注意事項

    免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展zui早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。
    免疫熒光技術(shù)按原理可分為直接法和間接法。所謂直接法就是將標(biāo)記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標(biāo)本上，經(jīng)過一定的溫度和時間的染色，用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢。
    那么在進(jìn)行直接免疫熒光法的操作時，有哪些是需要我們注意的呢？
    1.對熒光標(biāo)記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋度不應(yīng)超過1:20，抗體濃度過低，會導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱，影響觀察的結(jié)果;
    2.染色的溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原的變化，染色時間可以從10min到數(shù)小時，一般30min已足夠。染色溫度多采用室溫（25°C左右），高于37°C可加強染色效果，但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2°C的低溫，延長染色時間。低溫染色過夜較37°C30min效果好的多;
    3.為了保證熒光染色的正確性，首次試驗時需設(shè)置下述對照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。
    1)標(biāo)本自發(fā)熒光對照：標(biāo)本加1-2滴0.01mol/L,pH7.4的PBS;
    2)特異性對照（抑制試驗）：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體;
    3)陽性對照：已知的陽性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。
    如果標(biāo)本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，陽性對照和待檢標(biāo)本呈強熒光，則為特異性陽性染色。
    4.一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過3min，就有熒光減弱現(xiàn)象，經(jīng)熒光染色的標(biāo)本zui好在當(dāng)天觀察，隨著時間的延長，熒光強度會逐漸下降。
    間接法就是在檢查位置抗原時，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（di一抗體）與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)，用水洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng)，使之形成抗原-抗體-抗體復(fù)合物，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查位置抗體，則表明抗原標(biāo)本是已知的，待檢血清為di一抗體，其他步驟的抗原檢查相同。
    標(biāo)記的抗體是抗球蛋白抗體，同于血清球蛋白有種的特異性，如免疫抗雞血球蛋白只對雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng)，因此，制備標(biāo)記抗體適用于雞任何抗原的診斷。
    操作間接免疫熒光法時我們應(yīng)注意以下幾點：
    1.熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4°C保存4h，時間過長，會使熒光減弱;
    2.每次試驗時，需設(shè)置以下三種對照：
    1)陽性對照：陽性血清+熒光標(biāo)記物
    2)陰性對照：陰性血清+熒光標(biāo)記物
    3)熒光標(biāo)記物對照：PBS+熒光標(biāo)記物
    3.已知抗原標(biāo)本片需在操作的各個步驟中，始終保持濕潤，避免干燥;
    4.所滴加的待檢抗體標(biāo)本或熒光標(biāo)記物，應(yīng)始終保持在已知抗原標(biāo)本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色。