熒光顯微鏡壽命成像原理

      熒光壽命是指分子受到光脈沖激發(fā)后返回基態(tài)之前在激發(fā)平均停留的時(shí)間，處于激發(fā)態(tài)的熒光分子在從激發(fā)到基態(tài)的過(guò)程中發(fā)射熒光釋放能量。熒光壽命取決于熒光分子所處的微環(huán)境，通過(guò)對(duì)樣品熒光壽命的測(cè)量和成像可以定量獲取樣品的功能信息。
   

    熒光壽命成像技術(shù)有兩種：時(shí)間域和頻率域。
   

  （1）時(shí)域FLIM：需要脈沖光源，所以一般在雙光子的系統(tǒng)上比較常見(jiàn)FLIM（熒光壽命成像Fluorescence Life-time imaging Microcopy簡(jiǎn)稱(chēng)FLIM），理由一是激光是脈沖的，二是買(mǎi)雙光子的老師一般也搭配一個(gè)FLIM。如果是在單光子系統(tǒng)上的話(huà)，就需要買(mǎi)可見(jiàn)光波段的pulsed laser了。光路調(diào)節(jié)也是一個(gè)問(wèn)題，提供的廠(chǎng)家一般是Becker&Hickl,和PicoQuant，德國(guó)公司。這個(gè)方法比較流行，也有很多系統(tǒng)。
   

  （2）頻域FLIM：需要一個(gè)相位調(diào)制的光源，有用LED調(diào)制的，荷蘭的Lambert-Instrument就有這樣一套產(chǎn)品，是在wide-field的熒光顯微鏡上搭的，也有在共聚焦上的。
    FLIM對(duì)很多研究都有幫助，只是在生物領(lǐng)域的影響力不大，都是一些物理背景的科研人員在做。覺(jué)得用ＦLIM-FRET的方法得出結(jié)果，比單純intensity FRET拿到的數(shù)據(jù)可靠得多。
   

以下為熒光壽命成像FLIM的應(yīng)用：
    1）細(xì)胞體自身熒光壽命分析；
    2）自身熒光相對(duì)熒光標(biāo)記的有效區(qū)分；
    3）具有相同頻譜性質(zhì)的不同熒光標(biāo)記的區(qū)分；
    4）活細(xì)胞內(nèi)水介質(zhì)的PH值測(cè)量；
    5）局部氧氣濃度測(cè)量；
    6）活細(xì)胞內(nèi)鈣濃度測(cè)量；
    7）時(shí)間分辨Forster共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）：納米級(jí)尺度上的遠(yuǎn)程測(cè)量，環(huán)境敏感的FRET探針定量測(cè)量。